前言
大多数高等植物细胞的细胞外基质是由多糖、多酚和蛋白质组成的复合物，称为细胞壁。这些细胞壁是植物生理学的许多方面的关键。高等植物有两种细胞壁，初生和次生。
大多数植物细胞合成的原代细胞壁决定了细胞形状的发育，并影响组织形态发生。细胞壁作为外部世界的屏障，防止病原体感染和干燥。
血管和纤维中专门增厚的次生细胞壁支持直立生长和通过整个植物运输水，这是对陆地生态系统的一个重要适应。
种子的准备和在土壤上的生长
为了使土壤生长，将种子放在埃彭多夫管中的冷水中，用箔纸包裹，在4ºC处分层48小时。然后将种子播种到由莱文顿m3堆肥和蛭石组成的土壤上。
植株在16小时光照和8小时黑暗循环中生长，60%湿度，21ºC。这些植物生长了6-8周，并在需要时定期用去离子水浇水。
为了进行水培生长，种子在80%乙醇中消毒5分钟。然后分别用65%、80%和100%的乙醇清洗，并在层流罩中干燥。
将无菌种子播种到0.8%琼脂平板上，加入½强度的小鼠和小鼠盐和1%蔗糖，调整pH为5.8。盘子用箔纸包裹，并在4ºC下分层48小时。然后在上述条件下，这些植物在培养皿中生长两周。
水培生长
两周大的植株被移植到铝箔覆盖的石棉中，石棉在蒸馏水中浸出。这些植物是生长在上述光照和温度条件下的。
植物每周用水培溶液浇水两次，直到它们6-8周龄，第一个角质果变成棕色，原液用西格maAldrich试剂生产，并在MilliQ水中制备。
当第一个角质果开始变黄时，收获茎的基部五分之一，约6厘米，用于空气制备。茎在70ºC中99.8%乙醇的溶液中煮沸半小时。然后将茎在乙醇中球磨10分钟，在Retsch MM 400中以25转/分的速度磨球，直到变成细粉。
小球在50 ml的Falcon管中旋转，上清液处理后，用99.8%的乙醇洗涤。重复旋转，然后每次清洗都处理好上清液。用2小时2：3甲醇/Ch3Cl洗涤，然后用相同的混合物清洗过夜。然后依次用99.8%、65%、80%、99.8%的乙醇清洗球团，然后在50ºC下干燥。
对于球磨干燥的生物量，同样的茎在室温下干燥两周。将8 mg干茎在8ml0.1M醋酸铵pH 5.0缓冲液中球磨三次，每次10分钟，在Retsch MM 400中以25 rpm的转速进行，每个研磨时间之间的冷却时间为10分钟。
撒曼水解
0.5 mg等分的球磨干燥生物质在室温下用125µl 72%硫酸水解3小时。然后将样品加入10 mmol肌醇，然后用MilliQ水稀释至总体积为1.5 ml，在100ºC下水解2.5小时。然后将样品放在冰上冷却。
将一半的样品放入15毫升的Falcon管中，用等体积的MilliQ水稀释。用碳酸钡中和酸，用pH纸测试pH。样品在3000X g下旋转10分钟，然后使用上清液用HPAECPAD，使用CarboPac PA20定量单糖，通过运行标准来计算每个生物复制的响应曲线。
CTec2糖化混合物的脱盐和稀释
根据制造商的说明，使用西班牙素25 PD-10柱，从Cellic®CTec2，也就是新酶混合物中，去除多余的盐和单/低聚糖。
此后，该产品将被称为CTec2。柱缓冲液用25 ml 0.1 M醋酸铵pH 5.0缓冲液交换。将350µl的CTec2加入到2.15 ml的0.1 M醋酸铵pH 5.0缓冲液中。
将2.5 ml的体积通过PD- 10柱，用3.5 ml的0.1 M醋酸铵pH 5.0缓冲液洗脱。然后将脱盐后的1：10 CTec2溶液在4°C下保存不超过1个月。
CTec2糖化
将20µl 1：10 CTec2稀释液加入0.5ml1ml-1球磨干燥生物质中，加入1.5 ml埃彭多夫管中。将试管放置在45°C的埃彭多夫热混合器中24小时。
管子被摇晃30秒，然后在这24小时内的重复循环中放置4分钟。管子被涡旋，然后在4°C离心机中以15000rpm的转速旋转。
根据制造商的说明，使用D-葡萄糖检测试剂盒和D-木糖检测试剂盒在试管中测定上清液中的葡萄糖和木糖的浓度。单独使用CTec2的阴性对照和非糖化生物量被用来调整来自任何一个来源的背景单糖的读数。每种试验都用纯木糖或葡萄糖溶液生成一个标准曲线。
溶液核磁共振的酶解
将500mgAIR悬浮于25 ml 0.5%草酸铵中，加热至85ᵒC 2小时。将混合物以3700 rpm旋转10分钟，并将上清液处理好。小球用50毫升MilliQ水中洗涤。
为了使AIR脱木质素，在球团中加入40毫升11%的过氧乙酸，在85ᵒC下以750 rpm摇匀30分钟。将混合物以3700 rpm旋转10分钟，并将上清液处理好。用50 ml丙酮和MilliQ水重复这个过程，直到上清液为pH 7。
最后用100%乙醇清洗。为了提取木聚糖和相关的木质素，我们加入了25 ml的DMSO，并将样品加热至80ᵒC 24小时。以5000 rpm旋转10分钟，保留上清液。重复提取DMSO，并汇集上清液。提取的多糖在20 mM pH 7.0醋酸铵缓冲液中交换，使用PD-10柱交换。
其中3.5 ml分别用15 μl乙酰木聚糖酯酶和50 μl AaGH10消化。样品在45ᵒC下消化24小时，以750 rpm振荡。
然后用C-18柱进行固相萃取，纯化样品。使用注射器应用溶剂，柱用10毫升100%乙醇洗涤，然后用20 ml MilliQ水和2ml100%乙腈。然后用10ml20mM pH 7.0醋酸铵缓冲液平衡柱。然后将3.5 ml的样品装入柱上。
然后用10 ml MilliQ水、5 ml 10%乙醇、5ml20%乙醇和10ml100%乙醇洗涤柱；每个部分分别收集在15 ml Falcon管中。最后后用PACE或溶液NMR对样品进行分析。
木聚糖酶和葡聚糖酶的可及性
将0.5 mg球磨干燥的生物质悬浮于0.5 ml pH 6.0 0.1 M醋酸铵缓冲液中。在溶液中加入10µl AaGH10、6µl乙酰木聚糖酯酶和10µl GH115，以评估木聚糖的可及性。
加入10µl GH45内切葡聚糖酶、10µl GH7纤维素生物水解酶和5µlβ-葡萄糖苷酶来评价纤维素易接近样品在45°C下孵育过夜24小时。将试管涡旋，然后在4°C离心机中以15000rpm的速度旋转10分钟。
为了将寡糖从其他的生物质中分离出来，除去上清液，放入一个新的试管中。用0.5 ml pH 5.5 0.1 M醋酸铵缓冲液清洗球团。
将样品重新涡旋，并将洗涤上清液加入到消化上清液中。然后将1：10 CTec2稀释液20µl加入1 ml上清液中。将试管放置在45°C的埃彭多夫热混合器中24小时。
管子被摇晃30秒，然后在这24小时内重复循环放置4分钟。管子被涡旋，然后在4°C的离心机中以15000rpm的转速旋转。按照说明，使用中葡萄糖测定试剂盒和中木糖测定试剂盒测定上清液中的葡萄糖和木糖的浓度。
水解样品真空干燥，用5µl 0.2 M 8-氨基萘-1,3,6-三硫酸在10µl缓冲液中加入20：3：17的DMSO，乙酸和水和5µl 0.2 M米皮卡林硼烷在37ºC过夜。
样品真空干燥，在3M尿素中重悬。将每个样品的2.5µl装入PACE凝胶孔中。PACE凝胶由10%的聚丙烯酰胺凝胶在0.1 M三羟甲基氨基甲烷硼酸盐pH 8.2缓冲液中组成。凝胶宽24厘米，深0.025厘米。
样品在Hoefer SE 660系列垂直凝胶中，在1000 V下电泳45分钟，并冷却至10ºC。凝胶使用G-box相机成像，波长为365 mm。
拟南芥的遗传转化
基因构建采用Goldengate模块化克隆方法构建，在金酸克隆中，启动子、CDS、终止子和标记等L0部分被组装成L1转录单位。
将L1转录单位组装成L2二元载体，可转化为根癌农杆菌，使植物得以转化。金酸法使用IIS型限制性内切酶进行切割留下四个碱基对的DNA悬在与它们的识别位点有一定距离的距离上。
仔细设计的悬挑使切割和有序的DNA部分组装成正确的顺序。
DNA部分、限制性内切酶和T4 DNA连接酶被包含在一锅反应混合物中。限制和结扎的循环使该结构的生产成为可能。具体来说，混合物在热循环器中孵育，以下程序25个循环，37°C 3分钟，然后16°C 4分钟，50°C酶变性，最后80°C每次5分钟。
然后使用标准的热休克方案将混合物转化为NEB DH5α E.coli感受态细胞。将细胞与相关的选择成分一起镀在LB琼脂板上。将培养皿在37°C下孵育过夜。培养物从单个菌落中培养，并使用Qiagen微型制备试剂盒回收质粒。
利用L2质粒，采用标准的热休克方案转化GV3101根癌农杆菌。将细胞置于含有卡那霉素和庆大霉素的LB琼脂上，并在30°C下孵育2天。为了转化4周龄的拟南芥，我们采用了花的浸渍法。
选择单个GV3101菌落，在相关抗生素的LB培养中培养。过夜培养接种较大的培养物，培养至OD值600，约为0.6。
将细胞以3000 rpm成球，并在浸渍溶液中重悬。将花浸入浸渍液中1分钟。浸过的植物被装袋装了两天。袋子被移走，让植物继续生长和衰老。通过荧光技术从油球蛋白-GFP融合蛋白中选择转化后的种子。
固态核磁共振
岩棉中的植物被放置在一个有透明盖子的密封室中。
在空气中擦洗12CO2，并与13CO2以2000：1的比例重新混合。然后在这种大气中以相同的光照水平生长。温度为25ºC。
每周用的水培养基浇水，Ca2+浓度为1 mM。这些植株在生长6周后就被收获了。采集基部3厘米的茎，并在液氮中冷冻。然后将它们储存在-80ºC下，直到实验进行。将35-50 mg基底茎装入3.2 mm MAS探针。
cp不足和CP-PDSD实验是由沃里大学的Ray Dupree教授在布鲁克850MHz推进III固态核磁共振波谱仪上进行的。MAS的纺丝速度为12.5 kHz，样品温度在25-30ºC之间。
以177.8 ppm的l-丙氨酸作为四甲基硅烷的外部参考，确定了13C的化学位移。通过傅里叶变换得到4 K（F2）×2 K（F1）点，F2中指数线展宽为50Hz，F1中采用90°位移平方正弦钟处理。数据在TopSpin 4.0中进行处理。
结语
这些实验是由卡洛斯·e·德里梅尔博士进行的。球磨干燥的生物质样品在去离子水中条件处理24小时。样品被转移到铝平底锅中并密封。
空的和填充的锅的质量是用重量法确定的。实验结束时，样品在105°C下干燥，并用重量法测定其质量。这些值被用于确定干样品的质量。